Legionella analysis

Real Time PCR detectie van Legionella bacteriŽn

Algemeen

BioVisible gebruikt de geavanceerde DNA-testkit voor het aantonen en quatificeren van legionella bacteriŽn nu 8 jaar. De QuickScan (qPCR) verbeterd de NEN6265 in snelheid en betrouwbaarheid. Momenteel is alleen de NEN 6265 wettelijk erkend. Echter VROM heeft het gebruik van de QuickScan officiel toegestaan voor het vrijgeven van besmette locaties. Bovendien heeft BioVisible de goedkeuring voor het uitvoeren van microbiologische analyses op legionella bacteriën onder de norm van sterlab NEN-ISO 17025. De FastService dient te worden gezien als een snelle Analyse Service voor het aantonen van legionella in watermonsters.
De FastService maakt gebruik van een combinatie van de testen QuickScan en NEN 6265. Hiermee heeft men en de snelheid en betrouwbaarheid van de QuickScan en de wettelijke verplichting van de NEN 6265. Dit document is bedoeld ter informatie en achtergrond, behorende bij de Legionella FastService detectie methode zoals deze door BioVisible wordt uitgevoerd. Van belang is dat de gebruiker de keuze heeft uit verschillende technieken en de verschillende positieve aspecten en tekortkomingen onderkend. Dit alles om de juiste keuze te maken en de resultaten hiervan goed te interpreteren en aan te wenden.

NEN 6265

pcr

Legionella pneumophila kolonie

De huidige detectie methode voor het aantonen van de Legionella bacterie, de NEN6265, maakt gebruik van het vermogen van de Legionella bacterie om te groeien op een specifieke voedingsbodem. Door de groei van 1 bacterie op de plaat verschijnt na ca. 5 dagen 1 kolonie. Dit noemt men 1 KVE (kolonie vormende eenheid) De NEN6265 heeft een aantal nadelen en onvolkomenheden:

  • In de wetenschappelijke literatuur wordt veelvuldig aangegeven dat de Legionella bacterie niet altijd in staat is om te groeien op de door de NEN 6265 voorgeschreven voedingsbodem.

  • In het waterleidingnet zijn de omstandigheden voor de Legionella bacterie niet altijd optimaal. Een overlevingsstrategie van de bacterie is het uitschakelen van een aantal processen zodat de bacterie lange tijd kan overleven onder slechte omstandigheden. Een nadeel van deze strategie is dat, indien de bacterie betere omstandigheden treft (bv groeimedium), het lang duurt voordat de bacterie alle processen weer heeft aangeschakeld voor een snelle groei. De bacterie kan niet direct en snel groeien (slaat niet aan) op de aangeboden NEN 6265 groei media en wordt dan als negatief aangemerkt.

  • Amoeben zijn vaak aanwezig in het waterleidingnet. De Legionella bacterie kan zich in deze eencellige dieren voortplanten. Een amoebe kan tot ca. 300 Legionella bacteriën bevatten en toch niet in die hoeveelheden aantoonbaar zijn met de NEN6265 methode. Immers de 300 die vrijkomen op de plaat zullen na groei als 1 kolonie op de plaat ( 1 KVE) worden geteld.

  • De beoordeling van de platen na 5 dagen kweek op het voorkomen van Legionella (een verdachte plaat) is deels persoonsgebonden en derhalve weinig betrouwbaar. Tevens kan het zijn dat door overgoei van ander soorten en schimmels de platen helemaal niet te beoordelen zijn.

  • 50 KVE is eigenlijk de laagste waarde van de NEN 6265 (0-waarde). Er kunnen gemakkelijk statistische fouten worden gemaakt door de uitverdunning fouten die de methode met zich mee brengt.

Kortom de NEN 6265 heeft een aantal belangrijke tekortkomingen. Hetgeen tot uiting is gekomen in uitgevoerde ringtesten, welke een grote spreiding aangeven van < 50 KVE tot ca. 100.000 KVE.

QuickScan

pcr

Real time PCR grafiek met verschillende concentraties Legionella bacteriën.

Deze methode is niet afhankelijk van de groei van de bacterie. Nadat de bacteriën zijn geïsoleerd (gefilterd) uit het water wordt het DNA (het erfelijk materiaal van de bacterie) uit deze bacteriën geëxtraheerd. Het geëxtraheerde DNA wordt vervolgens vermeerderd. Hiervoor wordt de PCR (polymerase chain reaction) techniek gebruikt. De PCR zorgt voor een logaritmische vermeerdering van het specifieke Legionella DNA. Dat wil zeggen dat indien de reactie met 1 Legionella bacterie wordt gestart er binnen 20 minuten meer dan 1 miljoen kopieën van het Legionella DNA aanwezig zijn. De vermeerdering van het Legionella DNA kan door middel van een derde fluorescente en specifieke Legionella probe 'real-time' worden aangetoond. Naarmate er dus veel bacteriën in het water hebben gezeten zal het fluorescentie signaal eerder worden verkregen. De Legionella QuickScan test is kwantitatief genormeerd met, in aantal gedefinieerde, goed groeiende Legionella bacteriën. Deze normering bestaat uit een vergelijking van het aantal KVE aanwezig in een watermonster, met de uitkomst van de QuickScan, welke wordt uitgedrukt in Legionella DNA Eenheden ofwel LDE. In het laboratorium is het aantal KVE gelijk aan het aantal LDE. De QuickScan heeft een aantal belangrijke voordelen boven de NEN 6265

  • De resultaten zijn binnen 3 tot 4 uur bekend i.p.v. 7-12 dagen.

  • De DNA test is eenduidig en nauwkeurig. De probes en primers matchen en zijn specifiek voor de groep Legionella en niet voor anderen zoals Pseudomonas soorten. Hiermee is de beoordeling eenduidig en niet afhankelijk van de ervaring van personen met meer of minder ervaring.

  • De test is gevoeliger < 10 LDE.

  • De test is niet afhankelijk van de fysiologie van de Legionella bacterie. Legionella bacteriën die door de condities van het water (weinig nutriënten) zich in een soort van 'honger'fase (starvation) bevinden en dus VBNC (viable but not culturable: levend maar niet kweekbaar) zijn kunnen ook door de DNA-test worden aangetoond. Tevens is het zo dat DNA-test de Legionella bacteriën die zich in eencellige organismen (w.o. amoeben) hebben verscholen kwantitatief aantoont.

  • Minder belastend voor het milieu.

  • De test is goedkoper

  • De test kan zeer goed worden geautomatiseerd.


Praktijk

In praktijk monsters kan het voorkomen dat met de NEN 6265 geen tot weinig Legionella bacteriën worden aangetroffen terwijl de QuickScan zeer duidelijk positief is. Hiervoor zijn een aantal redenen aan te geven:

  • De Legionella bacterie is in de VBNC (viable but not culturable: levend maar niet kweekbaar) vorm aanwezig;
  • De Legionella bacteriën zijn wel aanwezig maar zitten “opgesloten” in amoeben, tot 300 bacteriën per amoebe.

De Legionella QuickScan methode is ongevoelig voor de fysiologie van de bacterie en toont de aanwezigheid van de bacterie al dan niet in amoeben altijd aan. Vandaar dat voor QuickScan en de NEN 6265 onderscheid gemaakt wordt tussen LDE (Legionella DNA Eenheden) en KVE (Kolonie Vormende Eenheden).

BioVisible heeft een groot aantal (>2000) analyses uitgevoerd op praktijkmonsters waar de NEN 6265 wordt vergeleken met de Legionella QuickScan. In alle gevallen dat de NEN 6265 positief was werd met de QuickScan een positief resultaat gevonden. De Legionella QuickScan toont zowel de kweekbare als niet kweekbare Legionella bacteriën aan.

Levend/Dood
Een veel gestelde vraag is of de Legionella QuickScan methode een onderscheid kan maken tussen dode of levende cellen. Met de QuickScan meten we alleen de levende en de nog intacte bacteriën. Wanneer de bacterie dood is zal de celwand al snel openbreken (lyseren) en zal de bacterie haar DNA in het water verliezen. Het DNA wat vrij komt in het water wordt tijdens filtratie weggespoeld, alle dode (gelyseerde) bacteriën worden niet gemeten.

Interpretatie van de QuickScan DNA test
Uit de uitgevoerde analyses van BioVisible blijkt dat, in alle gevallen, de Legionella QuickScan gelijke of grotere hoeveelheden bacteriën vindt in vergelijking met de NEN 6265 plaat methode (LDE vs KVE). De QuickScan kan geen indicatie geven over de pathogeniteit van de bacterie maar toont wel de aanwezigheid van de bacterie aan in de juiste hoeveelheden!

De onderstaande tabel geeft een indruk van hoe de uitslag van de Legionella QuickScan geïnterpreteerd dient te worden:

Groen = Veilig
Met beide methoden is geen Legionella aangetoond. Er is goede reden aan te nemen dat de leiding Legionella vrij is geweest bij monstername. Geen garantie voor de blijvende afwezigheid van Legionella.

Geel = Verdacht
Beide methoden tonen een hoeveelheid Legionella bacteriën aan. De hoeveelheid is zorgwekkend. De omstandigheden in het waterleidingnet vormt een risico voor nog grotere besmettingen (N.B. de huidige norm is 100 KVE/l). Spoeling is noodzakelijk.  

Rood= Besmet
Alarmfase: Er is een grote hoeveelheid Legionella aangetroffen. Spoeling is noodzakelijk. Monitoring met de QuickScan kan in kaart brengen waar de bron van besmetting in het waterleidingnet zit. De QuickScan bepaald binnen 4 uur het effect van spoeling waarna de locatie weer vrijgegeven kan worden (Toezegging van VROM voor vrijgave installatie.

De Legionella Fast Service is alleen (standaard) beschikbaar in Nederland. Voor (niet standaard) vragen graag contact opnemen met Mr. J. de Vogel: j.vogel@biovisible.com